2 × Taq Platinum PCR Mix

Ультрачыстая термостабильная ДНК-палімераза HotStart з высокай дакладнасцю.

Taq Platinum DNA Polymerase-гэта хімічна мадыфікаваная HotStart Taq палімераза з актыўнасцю 3'-5 'экзануклеазы і актыўнасцю 5'-3' экзануклеазы. Ферментная актыўнасць Taq Platinum DNA Polymerase блакуецца пры пакаёвай тэмпературы. Яго актыўнасць можа быць актываваная толькі пасля нагрэву пры 94 ° С на працягу 5-10 хвілін, што дазваляе пазбегнуць неспецыфічнай ампліфікацыі, выкліканай неспецыфічным адпалам грунтоўкі або дымерам грунтоўкі пры нізкай тэмпературы перад пачатковым цыклам рэакцыі ПЦР, і значна палепшыць адчувальнасць і спецыфічнасць рэакцыі ПЦР. Акрамя таго, ДНК -палімераза Taq Platinum валодае вельмі высокай дакладнасцю, што саступае найлепшым месцам пасля палімеразы Pfu. Хуткасць пашырэння ДНК -полімерызацыі хутчэй, чым палімеразы Pfu, і эфектыўнасць ампліфікацыі вышэй.

Котка. Не Памер ўпакоўкі
4992789 5х1 мл
4992790 5 × 1 мл

Дэталь прадукту

Эксперыментальны прыклад

Пытанні і адказы

Тэгі прадуктаў

Вызначэнне дзейнасці

1 адзінка (U) Taq Platinum DNA Актыўнасць палімеразы вызначаецца як колькасць фермента, неабходнае для ўключэння 10 нмоль дэзаксінуклеатыдаў у нерастваральныя ў кіслаце рэчывы пры 74 ° C на працягу 30 хвілін з выкарыстаннем актываванай ДНК спермы ласося ў якасці шаблону/праймера.

Кантроль якасці

Чысціня па выяўленні SDS-PAGE складае больш за 99%; Актыўнасць экзагеннай нуклеазы не выяўлена; Ген з адной копіі ў геноме чалавека можна эфектыўна ўзмацніць; Пры захоўванні пры пакаёвай тэмпературы на працягу аднаго тыдня значныя змены актыўнасці не змяняюцца.

Асноўныя тэхнічныя параметры

Ён валодае 5'-3 'экзануклеазнай актыўнасцю і 3'-5' экзануклеазнай актыўнасцю, а яго вернасць знаходзіцца побач з палімеразай Pfu. Хуткасць пашырэння Taq Platinum Polymerase хутчэй, чым Pfu палімеразы, і эфектыўнасць узмацнення вышэй. Прадукты ПЦР можна непасрэдна лигировать да тупога канца або кланаваць вектарам ТА. Калі неабходна павысіць эфектыўнасць кланавання, рэкамендуецца спачатку ачысціць і дадаць 3'-dA навісі перад кланаваннем у вектар ТА.

Аднатрубная Taq Platinum MasterMix (Нацыянальная сертыфікацыя высокатэхналагічных прадуктаў)

■ Taq Platinum MasterMix палепшыў спецыфічнасць і адчувальнасць рэакцыі ПЦР і можа ўзмацняць складаныя шаблоны з высокім утрыманнем ГХ, другаснай структурай і да таго падобнае. Можна павялічыць толькі 2 копіі мэтавага шаблону, што забяспечвае больш дакладныя эксперыментальныя вынікі.

■ Унікальная формула Taq Platinum MasterMix робіць усю сістэму рэакцыі вельмі стабільнай, і на актыўнасць не паўплывае паўторнае замарожванне-адліга або доўгае захоўванне пры 4 ° C.

■ Стабільны і эфектыўны загадзя прыгатаваны ПЦР змешаны раствор можа зрабіць аперацыю хуткай і простай, значна зніжаючы працаёмкасць і памылку выбаркі. Высокаэфектыўны ўзмацняльнік і аптымізатар ПЦР таксама ўваходзяць у сумесь, што зніжае патрабаванні да ўмоў ПЦР.

■ Гэты прадукт мае сістэмы, якія змяшчаюць фарбавальнікі і без фарбавальнікаў. Прадукты MasterMix, якія змяшчаюць фарбавальнікі, можна падвяргаць непасрэднай электрофорезе пасля ПЦР без дадання буфера загрузкі.

Прыкладанні

Ён можа замяніць палімеразу Pfu для ўзмацнення прадуктаў высокай дакладнасці са складаных шаблонаў, такіх як геномы, і падыходзіць для такіх прыкладанняў, як кланаванне генаў экспрэсіі, сайт-спецыфічныя мутацыі і аналіз палімарфізму адзінкавых нуклеатыдаў (SNP) і г.д.

Меры засцярогі пры распрацоўцы праймераў ПЦР:

Даўжыня грунтоўкі звычайна складае 20-25 мэр. Аднак пры правядзенні ПЦР з доўгім фрагментам даўжыню праймера трэба павялічыць да 30-35 мэр.

■ Няма ніякіх дадатковых спалучэнняў паміж двума праймерамі, асабліва для апошніх 3 баз на 3 ′ канцы.

■ Утрыманне ГХ павінна складаць 50-60%і пазбягаць мясцовых багатых ГХ або АТ. Для таго, каб грунт і шаблон стабільна звязваліся, пазбягайце багатай структуры AT на 3 'канцы.

■ Пазбягайце грунтоўкі для адукацыі другаснай структуры.

■ Выберыце дзве грунтоўкі з тэмпературай Tm блізка адна да адной.

Разлік значэння Tm праймераў для ПЦР:

■ Калі грунтоўка менш за 20 мэр: Tm = 2 ° C × (A+T)+4 ° C × (G+C).

■ Калі грунтоўка больш за 20 мэр: Tm = 81,5+0,41 × (GC%)-600/л, дзе L-даўжыня грунтоўкі.

■ Усталюйце тэмпературу адпалу (Tm-5) ° C.

Увод грунтоўкі ПЦР

Адпаведную канчатковую канцэнтрацыю праймераў можна выбраць паміж 0,1 мкМ і 1,0 мкМ. Занадта нізкая канцэнтрацыя грунтоўкі прыводзіць да нізкага выхаду прадуктаў ампліфікацыі, а занадта высокая канцэнтрацыя грунтоўкі больш схільная неспецыфічнаму ўзмацненню. Звычайна, калі колькасць матричной ДНК вялікае або ў якасці матрыцы выкарыстоўваецца складаная матричная ДНК (напрыклад, ДНК геному чалавека), канцэнтрацыя праймера павінна быць ніжэй. Калі колькасць матричной ДНК невялікае або ў якасці матрыцы выкарыстоўваецца простая матричная ДНК (напрыклад, плазмидная ДНК і г.д.), канцэнтрацыя праймера павінна быць вышэй.

Усе прадукты можна наладзіць для ODM/OEM. Для падрабязнасцей,калі ласка, націсніце Індывідуальнае абслугоўванне (ODM/OEM)


  • Папярэдні:
  • Далей:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental ExampleExperimental Example Выкарыстоўвайце геномную ДНК у якасці шаблону для ампліфікацыі фрагмента 1 кб. Пасля рэакцыі ПЦР вазьміце 5 мкл для вызначэння электрафарэзу.
    Пытанне: Няма палас узмацнення

    Шаблон А-1

    ■ Шаблон змяшчае прымешкі бялку або інгібітары Taq і г.

    ■ Дэнатурацыя шаблону не завершана - адпаведна павялічце тэмпературу дэнатурацыі і падоўжыце час дэнатурацыі.

    ■ Дэградацыя шаблону-паўторна падрыхтуйце шаблон.

    Буквар А-2

    ■ Нізкая якасць грунтоўкі-паўторна сінтэзуйце грунтоўку.

    ■ Дэградацыя грунтоўкі - раздзяліце грунтоўкі з высокай канцэнтрацыяй на невялікі аб'ём для захавання. Пазбягайце шматразовага замарожвання і размарожвання або працяглага крыокансервавання пры 4 ° C.

    ■ Няправільная канструкцыя грунтоўкі (напрыклад, недастатковая даўжыня грунтоўкі, дымер, утвораны паміж грунтамі і г.д.)

    А-3 Мг2+канцэнтрацыя

    ■ Mg2+ занадта нізкая канцэнтрацыя - правільна павялічвайце Mg2+ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    А-4 Тэмпература адпалу

    ■ Высокая тэмпература адпалу ўплывае на звязванне грунтоўкі і шаблону. —— Знізіць тэмпературу адпалу і аптымізаваць стан з градыентам 2 ° C.

    A-5 Час падаўжэння

    ■ Кароткі час падаўжэння —— павялічвайце час падаўжэння.

    Пытанне: ілжывы станоўчы вынік

    З'явы: адмоўныя пробы таксама паказваюць паласы мэтавай паслядоўнасці.

    A-1 Забруджванне ПЦР

    ■ Перакрыжаванае забруджванне паслядоўнасці мішэні або прадуктаў ампліфікацыі - асцярожна, каб не адмовіць піпеткай пробу, якая змяшчае паслядоўнасць мішэні, у адмоўны ўзор або выліць іх з прабіркі для цэнтрыфугі. Рэагенты або абсталяванне варта аўтаклавіраваць для ліквідацыі існуючых нуклеінавых кіслот, а наяўнасць забруджвання трэба вызначыць з дапамогай эксперыментаў з адмоўным кантролем.

    ■ Забруджванне рэагентаў - разрабіце рэактывы на долі і захоўвайце пры нізкай тэмпературы.

    А-2 Праймr

    ■ Mg2+ занадта нізкая канцэнтрацыя - правільна павялічвайце Mg2+ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    ■ Няправільны дызайн грунтоўкі, і мэтавая паслядоўнасць мае гамалогію з нецэлевай паслядоўнасцю. —— Грунтоўкі для паўторнага афармлення.

    Пытанне: Неспецыфічнае ўзмацненне

    З'явы: паласы ампліфікацыі ПЦР не адпавядаюць чаканым памерах, вялікія ці малыя, або часам сустракаюцца як спецыфічныя паласы ампліфікацыі, так і неспецыфічныя паласы ампліфікацыі.

    Буквар А-1

    ■ Дрэнная спецыфічнасць грунтоўкі

    —— Грунтоўка для паўторнага афармлення.

    ■ Занадта высокая канцэнтрацыя грунтоўкі - правільна павялічвайце тэмпературу дэнатурацыі і падаўжайце час дэнатурацыі.

    А-2 мг2+ канцэнтрацыя

    ■ Mg2+ канцэнтрацыя занадта высокая —— Правільна знізіць канцэнтрацыю Mg2+: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    А-3 Тэрмастабільная палімераза

    ■ Празмерная колькасць ферментаў - адпаведна зніжайце колькасць ферментаў з інтэрвалам у 0,5 ЕД.

    А-4 Тэмпература адпалу

    ■ Занадта нізкая тэмпература адпалу-адпаведным чынам павялічце тэмпературу адпалу або прымеце двухступенчаты метад адпалу

    ПЦР-цыклы А-5

    ■ Занадта шмат цыклаў ПЦР —— Паменшыць колькасць цыклаў ПЦР.

    Пытанне: Плямістыя або размазаныя паласы

    Буквар А-1—— Слабая спецыфічнасць —— Перапраектуйце грунтоўку, змяніце становішча і даўжыню грунтоўкі, каб павысіць яе спецыфічнасць; або выканаць укладзеную ПЦР.

    Шаблон ДНК A-2

    —— Шаблон не чысты —— Ачысціце шаблон або вылучыце ДНК з дапамогай набораў для ачысткі.

    А-3 Мг2+ канцэнтрацыя

    —— Мг2+ канцэнтрацыя занадта высокая - правільна знізіць Mg2+ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    A-4 dNTP

    —— Занадта высокая канцэнтрацыя dNTP —— Адпаведна знізіце канцэнтрацыю dNTP

    А-5 Тэмпература адпалу

    —— Занадта нізкая тэмпература адпалу —— Адпаведна павялічце тэмпературу адпалу

    Цыклы А-6

    —— Занадта шмат цыклаў —— Аптымізаваць нумар цыкла

    Пытанне: Колькі матричной ДНК трэба дадаць у рэакцыйную сістэму ПЦР 50 мкл?
    ytry
    Пытанне: Як павялічыць доўгія фрагменты?

    Першы крок - выбар адпаведнай палімеразы. Звычайная палімераза Taq не можа карэктавацца з-за адсутнасці актыўнасці 3'-5 'экзануклеазы, і неадпаведнасць значна знізіць эфектыўнасць пашырэння фрагментаў. Такім чынам, звычайная Taq -палімераза не можа эфектыўна ўзмацняць фрагменты мішэні памерам больш за 5 кб. Для павышэння эфектыўнасці пашырэння і задавальнення патрэбаў узмацнення доўгіх фрагментаў варта выбраць палімеразу Taq са спецыяльнай мадыфікацыяй або іншую палімеразу высокай дакладнасці. Акрамя таго, узмацненне доўгіх фрагментаў таксама патрабуе адпаведнай карэкціроўкі дызайну грунтоўкі, часу дэнатурацыі, часу пашырэння, рН буфера і г. д. Звычайна грунтоўкі з 18-24 б.п. могуць прывесці да лепшага ўраджаю. Каб прадухіліць пашкоджанне шаблону, час дэнатурацыі пры 94 ° C трэба скараціць да 30 сек або менш за цыкл, а час павышэння тэмпературы да 94 ° C перад узмацненнем - менш за 1 мін. Больш за тое, усталяванне тэмпературы падаўжэння прыкладна на 68 ° C і праектаванне часу падаўжэння з хуткасцю 1 кб/мін можа забяспечыць эфектыўнае ўзмацненне доўгіх фрагментаў.

    Пытанне: Як палепшыць вернасць ампліфікацыі ПЦР?

    Частату памылак ампліфікацыі ПЦР можна знізіць, выкарыстоўваючы розныя ДНК -палімеразы з высокай дакладнасцю. Сярод усіх знойдзеных да гэтага часу ДНК -палімераз Taq фермент Pfu мае самую нізкую частату памылак і найвышэйшую дакладнасць (гл. Прыкладзеную табліцу). У дадатак да выбару ферментаў, даследчыкі могуць дадаткова знізіць хуткасць мутацыі ПЦР за кошт аптымізацыі ўмоў рэакцыі, у тым ліку аптымізацыі складу буфера, канцэнтрацыі тэрмастабільнай палімеразы і аптымізацыі колькасці цыклаў ПЦР.

    Напішыце сваё паведамленне тут і адпраўце яго нам