2 × Pfu PCR Mix

Шаблон А-1

■ Шаблон змяшчае прымешкі бялку або інгібітары Taq і г.

■ Дэнатурацыя шаблону не завершана - адпаведна павялічце тэмпературу дэнатурацыі і падоўжыце час дэнатурацыі.

■ Дэградацыя шаблону-паўторна падрыхтуйце шаблон.

Буквар А-2

■ Нізкая якасць грунтоўкі-паўторна сінтэзуйце грунтоўку.

■ Дэградацыя грунтоўкі - раздзяліце грунтоўкі з высокай канцэнтрацыяй на невялікі аб'ём для захавання. Пазбягайце шматразовага замарожвання і размарожвання або працяглага крыокансервавання пры 4 ° C.

■ Няправільная канструкцыя грунтоўкі (напрыклад, недастатковая даўжыня грунтоўкі, дымер, утвораны паміж грунтамі і г.д.)

А-3 Мг²⁺канцэнтрацыя

■ Mg²⁺ занадта нізкая канцэнтрацыя - правільна павялічвайце Mg²⁺ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg²⁺ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg²⁺ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

А-4 Тэмпература адпалу

■ Высокая тэмпература адпалу ўплывае на звязванне грунтоўкі і шаблону. —— Знізіць тэмпературу адпалу і аптымізаваць стан з градыентам 2 ° C.

A-5 Час падаўжэння

■ Кароткі час падаўжэння —— павялічвайце час падаўжэння.

З'явы: адмоўныя пробы таксама паказваюць паласы мэтавай паслядоўнасці.

A-1 Забруджванне ПЦР

■ Перакрыжаванае забруджванне паслядоўнасці мішэні або прадуктаў ампліфікацыі - асцярожна, каб не адмовіць піпеткай пробу, якая змяшчае паслядоўнасць мішэні, у адмоўны ўзор або выліць іх з прабіркі для цэнтрыфугі. Рэагенты або абсталяванне варта аўтаклавіраваць для ліквідацыі існуючых нуклеінавых кіслот, а наяўнасць забруджвання трэба вызначыць з дапамогай эксперыментаў з адмоўным кантролем.

■ Забруджванне рэагентаў - разрабіце рэактывы на долі і захоўвайце пры нізкай тэмпературы.

А-2 Праймr

■ Mg²⁺ занадта нізкая канцэнтрацыя - правільна павялічвайце Mg²⁺ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg²⁺ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg²⁺ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

■ Няправільны дызайн грунтоўкі, і мэтавая паслядоўнасць мае гамалогію з нецэлевай паслядоўнасцю. —— Грунтоўкі для паўторнага афармлення.

З'явы: паласы ампліфікацыі ПЦР не адпавядаюць чаканым памерах, вялікія ці малыя, або часам сустракаюцца як спецыфічныя паласы ампліфікацыі, так і неспецыфічныя паласы ампліфікацыі.

Буквар А-1

■ Дрэнная спецыфічнасць грунтоўкі

—— Грунтоўка для паўторнага афармлення.

■ Занадта высокая канцэнтрацыя грунтоўкі - правільна павялічвайце тэмпературу дэнатурацыі і падаўжайце час дэнатурацыі.

А-2 мг²⁺ канцэнтрацыя

■ Mg²⁺ канцэнтрацыя занадта высокая —— Правільна знізіць канцэнтрацыю Mg2+: Аптымізаваць Mg²⁺ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg²⁺ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

А-3 Тэрмастабільная палімераза

■ Празмерная колькасць ферментаў - адпаведна зніжайце колькасць ферментаў з інтэрвалам у 0,5 ЕД.

А-4 Тэмпература адпалу

■ Занадта нізкая тэмпература адпалу-адпаведным чынам павялічце тэмпературу адпалу або прымеце двухступенчаты метад адпалу

ПЦР-цыклы А-5

■ Занадта шмат цыклаў ПЦР —— Паменшыць колькасць цыклаў ПЦР.

Буквар А-1—— Слабая спецыфічнасць —— Перапраектуйце грунтоўку, змяніце становішча і даўжыню грунтоўкі, каб павысіць яе спецыфічнасць; або выканаць укладзеную ПЦР.

Шаблон ДНК A-2

—— Шаблон не чысты —— Ачысціце шаблон або вылучыце ДНК з дапамогай набораў для ачысткі.

А-3 Мг²⁺ канцэнтрацыя

—— Мг²⁺ канцэнтрацыя занадта высокая - правільна знізіць Mg²⁺ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg²⁺ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg²⁺ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

A-4 dNTP

—— Занадта высокая канцэнтрацыя dNTP —— Адпаведна знізіце канцэнтрацыю dNTP

А-5 Тэмпература адпалу

—— Занадта нізкая тэмпература адпалу —— Адпаведна павялічце тэмпературу адпалу

Цыклы А-6

—— Занадта шмат цыклаў —— Аптымізаваць нумар цыкла

Першы крок - выбар адпаведнай палімеразы. Звычайная палімераза Taq не можа карэктавацца з-за адсутнасці актыўнасці 3'-5 'экзануклеазы, і неадпаведнасць значна знізіць эфектыўнасць пашырэння фрагментаў. Такім чынам, звычайная Taq -палімераза не можа эфектыўна ўзмацняць фрагменты мішэні памерам больш за 5 кб. Для павышэння эфектыўнасці пашырэння і задавальнення патрэбаў узмацнення доўгіх фрагментаў варта выбраць палімеразу Taq са спецыяльнай мадыфікацыяй або іншую палімеразу высокай дакладнасці. Акрамя таго, узмацненне доўгіх фрагментаў таксама патрабуе адпаведнай карэкціроўкі дызайну грунтоўкі, часу дэнатурацыі, часу пашырэння, рН буфера і г. д. Звычайна грунтоўкі з 18-24 б.п. могуць прывесці да лепшага ўраджаю. Каб прадухіліць пашкоджанне шаблону, час дэнатурацыі пры 94 ° C трэба скараціць да 30 сек або менш за цыкл, а час павышэння тэмпературы да 94 ° C перад узмацненнем - менш за 1 мін. Больш за тое, усталяванне тэмпературы падаўжэння прыкладна на 68 ° C і праектаванне часу падаўжэння з хуткасцю 1 кб/мін можа забяспечыць эфектыўнае ўзмацненне доўгіх фрагментаў.

Частату памылак ампліфікацыі ПЦР можна знізіць, выкарыстоўваючы розныя ДНК -палімеразы з высокай дакладнасцю. Сярод усіх знойдзеных да гэтага часу ДНК -палімераз Taq фермент Pfu мае самую нізкую частату памылак і найвышэйшую дакладнасць (гл. Прыкладзеную табліцу). У дадатак да выбару ферментаў, даследчыкі могуць дадаткова знізіць хуткасць мутацыі ПЦР за кошт аптымізацыі ўмоў рэакцыі, у тым ліку аптымізацыі складу буфера, канцэнтрацыі тэрмастабільнай палімеразы і аптымізацыі колькасці цыклаў ПЦР.