Камплект хуткага мутагенезу, накіраваны на сайт

Хуткая мультысайтавая або мультысайтавая мутацыя на гене-мішэні ў вектары-мішэні.

Сайт-накіраваны мутагенез in vitro-важны эксперыментальны метад у розных галінах біялогіі і медыцыны, які ў асноўным выкарыстоўваецца для мадыфікацыі і аптымізацыі генаў-мішэняў, даследавання рэгуляторных сайтаў прамоўтэраў, а таксама вывучэння складанай сувязі паміж структурай і функцыяй бялку. Камплект выкарыстоўвае сучасную перадавую тэхналогію для непасрэднага правядзення мутацыі на адным участку, мутацыі на некалькіх участках, а таксама ўстаўкі або выдалення мутацыі на гене-мішэні. Частата мутацый аднасайтовай мутацыі можа дасягаць больш за 90%. Акрамя таго, у адрозненне ад традыцыйных набораў мутацый, якія патрабуюць некалькіх раўндаў ПЦР, субклонирования і іншых крокаў, якія адымаюць шмат часу і працы, праца камплекта прасцейшая, і для пабудовы мутантнага штаму неабходна ўсяго чатыры этапы.

Котка. Не Памер ўпакоўкі
44992901 20 рублёў

 

 


Дэталь прадукту

Пытанні і адказы

Тэгі прадуктаў

Асаблівасці

■ Просты і хуткі: У камплекце прынята тэхналогія ўзмацнення плазміды без замяшчэння. Каб рэалізаваць трансфармацыю з штаму дзікага тыпу ў мутантны, яму спатрэбяцца ўсяго 4 этапы, без працаёмкіх і працаёмкіх этапаў, такіх як некалькі раундаў ПЦР і субклонирования.
■ Высокаэфектыўная грунтоўка: У камплекце прыняты прынцып часткова перакрываючагася дызайну грунтоўкі, так што ампліфікацыяй можна атрымаць больш мутантных плазмід.
■ Шырока прымяняецца: камплект можа ажыццяўляць не толькі аднасайтовую мутацыю, але і мультысайтавую. Ён можа мутаваць да 5 сайтаў.
■ Надзейная адаптацыя: камплект можа праводзіць сайт-накіраваную мутацыю на плазмідах з максімальным памерам 10 kb, у асноўным ахопліваючы ўсе звычайна выкарыстоўваюцца плазміды.
■ Высокая хуткасць мутацый: набор мае функцыю падвойнага пераварвання метилированных шаблонаў плазміды in vitro і in vivo, забяспечваючы больш высокую хуткасць мутацый.

Настройка рэакцыі сайта-мутацыі і праграма ПЦР

■ Для мультысайтавай мутацыі з адным праймерам хуткасць мутацый будзе ніжэйшай, чым у мутацый аднаго сайта з-за павелічэння колькасці сайтаў мутацый. Паводле нашых эксперыментальных дадзеных, калі колькасць месцаў мутацый дасягне 5, станоўчая частата мутацый знізіцца да 50%. Таму ў гэтым выпадку рэкамендуецца павялічыць колькасць правераных клонаў.
■ Камплект падтрымлівае мульты-праймерную мутацыйную мутацыю, так што эксперыменты з мутацыямі можна адначасова праводзіць у больш шырокім дыяпазоне генаў. Верхняя мяжа колькасці месцаў мутацый па -ранейшаму складае 5.
■ Мяркуецца, што кантрольныя плазміды і праймеры, якія ўваходзяць у камплект, павінны прымяняцца пры правядзенні новых эксперыментаў з мутацыямі, каб палегчыць аналіз эксперыментальных задач.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Усе прадукты можна наладзіць для ODM/OEM. Для падрабязнасцей,калі ласка, націсніце Індывідуальнае абслугоўванне (ODM/OEM)


  • Папярэдні:
  • Далей:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Пытанне: Няма палас узмацнення

    Шаблон А-1

    ■ Шаблон змяшчае прымешкі бялку або інгібітары Taq і г.

    ■ Дэнатурацыя шаблону не завершана - адпаведна павялічце тэмпературу дэнатурацыі і падоўжыце час дэнатурацыі.

    ■ Дэградацыя шаблону-паўторна падрыхтуйце шаблон.

    Буквар А-2

    ■ Нізкая якасць грунтоўкі-паўторна сінтэзуйце грунтоўку.

    ■ Дэградацыя грунтоўкі - раздзяліце грунтоўкі з высокай канцэнтрацыяй на невялікі аб'ём для захавання. Пазбягайце шматразовага замарожвання і размарожвання або працяглага крыокансервавання пры 4 ° C.

    ■ Няправільная канструкцыя грунтоўкі (напрыклад, недастатковая даўжыня грунтоўкі, дымер, утвораны паміж грунтамі і г.д.)

    А-3 Мг2+канцэнтрацыя

    ■ Mg2+ занадта нізкая канцэнтрацыя - правільна павялічвайце Mg2+ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    А-4 Тэмпература адпалу

    ■ Высокая тэмпература адпалу ўплывае на звязванне грунтоўкі і шаблону. —— Знізіць тэмпературу адпалу і аптымізаваць стан з градыентам 2 ° C.

    A-5 Час падаўжэння

    ■ Кароткі час падаўжэння —— павялічвайце час падаўжэння.

    Пытанне: ілжывы станоўчы вынік

    З'явы: адмоўныя пробы таксама паказваюць паласы мэтавай паслядоўнасці.

    A-1 Забруджванне ПЦР

    ■ Перакрыжаванае забруджванне паслядоўнасці мішэні або прадуктаў ампліфікацыі - асцярожна, каб не адмовіць піпеткай пробу, якая змяшчае паслядоўнасць мішэні, у адмоўны ўзор або выліць іх з прабіркі для цэнтрыфугі. Рэагенты або абсталяванне варта аўтаклавіраваць для ліквідацыі існуючых нуклеінавых кіслот, а наяўнасць забруджвання трэба вызначыць з дапамогай эксперыментаў з адмоўным кантролем.

    ■ Забруджванне рэагентаў - разрабіце рэактывы на долі і захоўвайце пры нізкай тэмпературы.

    А-2 Праймr

    ■ Mg2+ занадта нізкая канцэнтрацыя - правільна павялічвайце Mg2+ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    ■ Няправільны дызайн грунтоўкі, і мэтавая паслядоўнасць мае гамалогію з нецэлевай паслядоўнасцю. —— Грунтоўкі для паўторнага афармлення.

    Пытанне: Неспецыфічнае ўзмацненне

    З'явы: паласы ампліфікацыі ПЦР не адпавядаюць чаканым памерах, вялікія ці малыя, або часам сустракаюцца як спецыфічныя паласы ампліфікацыі, так і неспецыфічныя паласы ампліфікацыі.

    Буквар А-1

    ■ Дрэнная спецыфічнасць грунтоўкі

    —— Грунтоўка для паўторнага афармлення.

    ■ Занадта высокая канцэнтрацыя грунтоўкі - правільна павялічвайце тэмпературу дэнатурацыі і падаўжайце час дэнатурацыі.

    А-2 мг2+ канцэнтрацыя

    ■ Mg2+ канцэнтрацыя занадта высокая —— Правільна знізіць канцэнтрацыю Mg2+: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    А-3 Тэрмастабільная палімераза

    ■ Празмерная колькасць ферментаў - адпаведна зніжайце колькасць ферментаў з інтэрвалам у 0,5 ЕД.

    А-4 Тэмпература адпалу

    ■ Занадта нізкая тэмпература адпалу-адпаведным чынам павялічце тэмпературу адпалу або прымеце двухступенчаты метад адпалу

    ПЦР-цыклы А-5

    ■ Занадта шмат цыклаў ПЦР —— Паменшыць колькасць цыклаў ПЦР.

    Пытанне: Плямістыя або размазаныя паласы

    Буквар А-1—— Слабая спецыфічнасць —— Перапраектуйце грунтоўку, змяніце становішча і даўжыню грунтоўкі, каб павысіць яе спецыфічнасць; або выканаць укладзеную ПЦР.

    Шаблон ДНК A-2

    —— Шаблон не чысты —— Ачысціце шаблон або вылучыце ДНК з дапамогай набораў для ачысткі.

    А-3 Мг2+ канцэнтрацыя

    —— Мг2+ канцэнтрацыя занадта высокая - правільна знізіць Mg2+ канцэнтрацыя: Аптымізаваць Mg2+ канцэнтрацыі серыяй рэакцый ад 1 мМ да 3 мМ з інтэрвалам 0,5 мМ для вызначэння аптымальнага Mg2+ канцэнтрацыя для кожнага шаблону і грунтоўкі.

    A-4 dNTP

    —— Занадта высокая канцэнтрацыя dNTP —— Адпаведна знізіце канцэнтрацыю dNTP

    А-5 Тэмпература адпалу

    —— Занадта нізкая тэмпература адпалу —— Адпаведна павялічце тэмпературу адпалу

    Цыклы А-6

    —— Занадта шмат цыклаў —— Аптымізаваць нумар цыкла

    Пытанне: Колькі матричной ДНК трэба дадаць у рэакцыйную сістэму ПЦР 50 мкл?
    ytry
    Пытанне: Як павялічыць доўгія фрагменты?

    Першы крок - выбар адпаведнай палімеразы. Звычайная палімераза Taq не можа карэктавацца з-за адсутнасці актыўнасці 3'-5 'экзануклеазы, і неадпаведнасць значна знізіць эфектыўнасць пашырэння фрагментаў. Такім чынам, звычайная Taq -палімераза не можа эфектыўна ўзмацняць фрагменты мішэні памерам больш за 5 кб. Для павышэння эфектыўнасці пашырэння і задавальнення патрэбаў узмацнення доўгіх фрагментаў варта выбраць палімеразу Taq са спецыяльнай мадыфікацыяй або іншую палімеразу высокай дакладнасці. Акрамя таго, узмацненне доўгіх фрагментаў таксама патрабуе адпаведнай карэкціроўкі дызайну грунтоўкі, часу дэнатурацыі, часу пашырэння, рН буфера і г. д. Звычайна грунтоўкі з 18-24 б.п. могуць прывесці да лепшага ўраджаю. Каб прадухіліць пашкоджанне шаблону, час дэнатурацыі пры 94 ° C трэба скараціць да 30 сек або менш за цыкл, а час павышэння тэмпературы да 94 ° C перад узмацненнем - менш за 1 мін. Больш за тое, усталяванне тэмпературы падаўжэння прыкладна на 68 ° C і праектаванне часу падаўжэння з хуткасцю 1 кб/мін можа забяспечыць эфектыўнае ўзмацненне доўгіх фрагментаў.

    Пытанне: Як палепшыць вернасць ампліфікацыі ПЦР?

    Частату памылак ампліфікацыі ПЦР можна знізіць, выкарыстоўваючы розныя ДНК -палімеразы з высокай дакладнасцю. Сярод усіх знойдзеных да гэтага часу ДНК -палімераз Taq фермент Pfu мае самую нізкую частату памылак і найвышэйшую дакладнасць (гл. Прыкладзеную табліцу). У дадатак да выбару ферментаў, даследчыкі могуць дадаткова знізіць хуткасць мутацыі ПЦР за кошт аптымізацыі ўмоў рэакцыі, у тым ліку аптымізацыі складу буфера, канцэнтрацыі тэрмастабільнай палімеразы і аптымізацыі колькасці цыклаў ПЦР.

    Напішыце сваё паведамленне тут і адпраўце яго нам